Titolo della Ricerca - A
"Influenza della silimarina sui livelli plasmatici di retinolo ed α-Tocoferolo nelle
bovine nel periparto".

Titolo della Ricerca - B
"Valutazione dell'effetto della silimarina sul metabolismo e sullo stato redox
plasmatico di capre nel periodo del periparto".

Titolo della Ricerca - C
"Valutazione dell'effetto della sulla locale sarda sull'accrescimento degli
agnelli, attraverso l'analisi dello stato redox plasmatico e del profilo metabolico".

Unità Operativa NAPOLI 1 - ISPAAM-CNR
via Argine 1085, 80147 Napoli
Dipartimento di Fisiologia Generale ed Ambientale - Università degli Studi di Napoli, Federico II
via Mezzocannone 8, Napoli. - Tel. 081 5966006 - Fax 081 5965291
Responsabile del progetto Prof. Lino Ferrara - lino@iabbam.na.cnr.it
Maria Stefania Spagnuolo.

Collaborazioni ricerca A e B:  U.O. Milano, resp. Prof Doriana Tedesco.
Collaborazioni ricerca C:       U.O. Sassari, resp. Dr. Simonetta Bullitta.
                                       U.O. Bonassai, resp. Dr. Sebastiano Ligios.

English version
 

  L’ossigeno, uno degli elementi essenziali per gli organismi aerobi, viene ridotto ad acqua grazie alla sua capacità di accettare elettroni; questa proprietà lo rende un potente ossidante e una delle cause principali dell’insorgenza di vari processi fisiopatologici. Le forme parzialmente ridotte dell’ossigeno sono radicali liberi o derivati ossidanti dei radicali liberi. Queste specie vengono genericamente indicate con l’acronimo ROS (reactive oxygen species).

I radicali liberi sono molecole che contengono un elettrone spaiato nel loro orbitale più esterno. Esempi tipici sono il radicale ossidrilico (OH ·) e l’anione superossido (O 2 -· ). Un altro potente agente ossidante è il perossinitrito (ONOO -), generato dall’interazione dell’ossido nitrico (NO) con l’anione superossido.

  PEROSSINITRITO

I principali processi biologici che portano alla formazione di ROS sono il trasporto di elettroni, associato alla membrana mitocondriale, e l’attività fagocitaria svolta dalle cellule leucocitarie quando inglobano le sostanze estranee e le degradano per azione dei loro enzimi idrolitici. La tossicità delle ROS è dovuta agli effetti, diretti o indiretti, su lipidi, proteine ed acidi nucleici. Il bersaglio principale dell’azione dei ROS è rappresentato dai lipidi, abbondantemente contenuti nelle membrane cellulari e nelle lipoproteine circolanti, le cui catene possono essere perossidate o rese radicaliche, dando inizio ad un processo autocatalitico di degradazione. Tale evento è associato alla comparsa di alterazioni delle proprietà fisiologiche delle membrane stesse e, di conseguenza, di tutta la cellula. Le alterazioni strutturali, causate dall’azione delle ROS sulle proteine, sono, in genere, rappresentate dalla trasformazione delle catene laterali degli aminoacidi in addotti, che modificano la conformazione e, di conseguenza, la funzione delle proteine stesse. Un esempio è rappresentato dai danni ossidativi causati dal perossinitrito, che può indurre la nitrazione delle tirosine: la misura dei livelli di nitrotirosine è utilizzata come indice di tali danni.

  NITROTIROSINA

La formazione di addotti delle ROS con il DNA, o l’apertura degli anelli aromatici purinici e pirimidinici causa danni strutturali che, se non riparati velocemente ed adeguatamente, provocano la perdita della funzione genica e l’avvio di programmi di morte cellulare. I sistemi biologici sono protetti contro gli attacchi ossidativi dei radicali liberi da vari tipi di sostanze antiossidanti, che, sequestrando i radicali liberi o inattivando le reazioni ossidative, costituiscono un efficace sistema di difesa.

Una eccessiva produzione di ROS e/o una diminuita capacità antiossidante all’interno dei tessuti creano uno spostamento dell’equilibrio proossidanti/antiossidanti a favore dei primi; questa condizione, definita di stress ossidativo, può determinare alterazioni struttuali e funzionali della cellula.

Il retinolo (vitamina A) e l’ a-tocoferolo (vitamina E) sono antiossidanti “scavenger” (spazzini): essi reagiscono con i radicali liberi per formare prodotti chimicamente stabili e rappresentano una linea di difesa primaria contro i processi ossidativi. Entrambi sono solubili nelle membrane e nei domini lipidici delle proteine ed hanno un ruolo cruciale nel prevenire o far terminare le reazioni ossidative a catena sui lipidi. Numerosi studi hanno dimostrato che retinolo ed a-tocoferolo hanno effetti immunoregolatori, negli animali e nell’uomo, in quanto promuovono l’attività citotossica e fagocitica dei linfociti e dei macrofagi, rispettivamente, e stimolano la produzione di citochine. Nei ruminanti, è stato ampiamente dimostrato che la supplementazione della dieta con antiossidanti conferisce una maggiore resistenza alle infezioni e contribuisce ad un miglioramento della performance produttiva e riproduttiva dell’animale.

PROVE EFFETTUATE
La silimarina (Silybum marianum L.) è una miscela di flavonolignani e possiede proprietà antiossidanti, antitossiche ed antiinfiammatorie. Ha, inoltre, un ruolo epatoprotettore e promuove la sintesi proteica e la rigenerazione delle cellule epatiche danneggiate.

La silimarina (dose di 1g/die) è stata somministrata a 10 bovine, sotto forma di sospensione orale, a partire da dieci giorni prima del parto; il trattamento è proseguito fino al 15° giorno di lattazione. Campioni di plasma sono stati prelevati 7 giorni prima del parto, al parto, 7, 14 e 21 giorni dopo il parto e la concentrazione di retinolo ed a-tocoferolo è stata determinata, mediante HPLC. Animali che non hanno ricevuto alcun trattamento sono stati utilizzati come controllo. La silimarina (dose di 1g/die) è stata somministrata a 15 capre, a partire da 7 giorni prima del parto fino al 15° giorno di lattazione. Campioni plasmatici sono stati prelevati 7 giorni prima del parto, al parto, 7, 14 e 21 giorni dopo il parto. In questi campioni è stata misurata la concentrazione di retinolo ed a-tocoferolo, nitrotirosine, colesterolo totale, trigliceridi e glucosio (parametri ematici utilizzati, comunemente, per la valutazione dello status energetico). Sono stati, inoltre determinati parametri ematici, da utilizzare come marcatori del metabolismo minerale (ceruloplasmina, Na, K, Mg, Cl), della funzionalità epatica (fosfatasi alcalina, GOT, bilirubina, albumina) e delle condizioni metabolico-nutrizionali (urea, lipasi e colesterolo-HDL). Animali che non hanno ricevuto alcun trattamento sono stati utilizzati come controllo. I livelli di antiossidanti liposolubili sono stati determinati in campioni di latte prelevati al 7°, 14° e 21° giorno di lattazione.

TITOLAZIONE DEGLI ANTIOSSIDANTI: i campioni plasmatici sono stati deproteinizzati mediante precipitazione con una miscela di isopropanolo/metanolo (1:1, v:v) e i due antiossidanti liposolubili sono stati frazionati su colonna di octadecilsilano (150 x 3.9 mm, 4 mm) in isopropanolo/metanolo/acqua (46.25/46.25/7.5, v:v:v). La rivelazione dell’eluato è stata effettuata per via spettrofluorimetrica. I campioni di latte, dopo idrolisi basica degli esteri di retinolo ed a- tocoferolo, sono stati analizzati come i campioni plasmatici.

TITOLAZIONE DELLE NITROTIROSINE: la concentrazione delle nitrotirosine (N-tyr) plasmatiche è stata determinata mediante ELISA, utilizzando anticorpi di pecora anti-N-tyr ed anticorpi di asino, contro la regione Fc degli anticorpi di pecora, coniugati a perossidasi. Dopo aggiunta del substrato della perossidasi (H2O2 ) ed OPD, i radicali prodotti dall’attività perossidasica reagiscono con l’OPD, formando un composto colorato: il colore che si sviluppa (misurato spettrofotometricamente con un lettore per micropiastre alla lunghezza d’onda di 492 nm) è proporzionale alla concentrazione dell’enzima legato all’anticorpo, che, a sua volta, rispecchia la concentrazione degli immunocomplessi formati tra anticorpo primario ed antigene. Le curve di calibrazione sono state costruite utilizzando BSA nitrata come standard.